Sanger Yönetimi

Şubat 2013 | Halil Ertekin, Yazılım Geliştirme Uzmanı
Sarah Obenrader tarafından
_____________________________________________
Bu web sayfası Davidson College'da bir lisans dersi için bir ödev olarak üretilmiştir.


Temel Bilgiler
Nükleotidlerin sırası: hepsinin en temel bilgileri bize sağladığı için DNA dizi bize DNA'nın ayrıntılı bir analiz gerçekleştirmesini sağlar.
Bu bilgi ile, örneğin, biz, düzenleyici ve gen dizileri bulabilir türler arasında homolog genleri arasında karşılaştırmalar yapmak ve mutasyonlar tespit.
Bilim adamları bu potansiyel çok güçlü bir araç olabileceğini kabul ve böylece dizisi DNA yaptığınız bir yöntem oluşturmak için bir rekabet vardı.
Ardından 1974 yılında, iki yöntem bağımsız tam olarak bunu yapmak için bir Amerikan ekibi ve bir İngiliz ekip tarafından geliştirilmiştir.
Sanger, İngilizce, kurşun, DNA replikasyonu doğal sürecine benzer bir prosedür olarak tasarlanmış iken Amerikalılar, Maxam ve Gilbert tarafından kurşun bir "kimyasal bölünme protokolü" kullanılmıştır.
Her iki takım 1980 Nobel Ödülü'nü paylaştı rağmen, Sanger metodu nedeniyle pratiklik (Hız, 1992) standart oldu.
Ayrıca dideoksi dizileme veya zincir sonlandırma olarak ifade edilir Sanger yöntemi, bir kullanımına dayanmaktadır
dideoksinükleotidleri
normal ek olarak (ddNTP) 'ın
nükleotid
DNA bulunan (NTP).
Bunun yerine, bir hidroksil grubunun 3 'karbon (OH) üzerinde, bir hidrojen grubu ihtiva dışında dideoksinükleotidleri esasen nükleotidleri ile aynıdır.
Bu modifiye edilmiş nükleotidler, bir dizi içine entegre olduğunda, daha fazla nükleotidlerin eklenmesi önler.
(Hız, 1992). Bu, bir fosfodiester bağı dideoksinükleotid ve bir sonraki gelen nükleotid arasında oluşması için oluşur, ve bu nedenle DNA zincir sona erdirilir.

Yöntem
DNA dizilimini edilebilir önce, ısı kullanılarak tek iplikçikler halinde denatüre olmak zorundadır.
Sonraki bir astar şablon ipliklerinin biri ile tavlanmış edilir.
Bu primer, özellikle onun 3 'ucuna ilgi DNA sekansı yanında yer alır ve böylece inşa edilmiştir.
Bu astar ya da nükleotidlerin bir ya da radyoaktif olarak ya da floresan nihai ürün (Russell, 2002) bir jel üzerinde tespit edilebilir ki böylece etiketlenmesi gerekir.
Astar DNA bağlı sonra, çözelti "G", "A", "T" ve "C" etiketli dört tüp içine bölünmüştür.
Daha sonra aşağıdaki gibi reaktifler bu örneğe ilave edilir:

"G" boru:
dört dNTP sitesi,
ddGTP
ve DNA polimeraz

"A" tüp:
dört dNTP sitesi,
ddATP
ve DNA polimeraz

"T" tüpünün:
dört dNTP sitesi,
ddTTP
ve DNA polimeraz

"C" boru:
dört dNTP sitesi,
ddCTP
ve DNA polimeraz
Yukarıda gösterildiği gibi, tüplerin her biri, normal öncüleri-hundreth yaklaşık konsantrasyon (Russell, 2002) farklı bir ddNTP mevcut ve her içerir.
DNA sentezi gibi, nükleotidler DNA polimeraz ile büyüyen zinciri için eklenir.
Bununla birlikte, zaman zaman, bir dideoksinükleotid normal bir nükleotid yerine zincir içine dahil edilmiştir, ki bir zincir-sonlandırma olay sonucunu verir.
Biz sadece baktı Örneğin

"G" tüp
, biz aşağıdaki ürünleri bir arada bulabilirsiniz:
Genetik
Şekil 1:
"G" tüp içinde üretilmiş olabilir potansiyel parçalarının bir örnek.
Parçaları ddGTP nin (Metzenberg) arasında rasgele entegrasyon nedeniyle tüm uzunlukları farklıdır.
Bu yöntem için anahtar, tüm reaksiyonlar, belirli bir baz ile aynı nükleotid ve uçtan başlamak olmasıdır.
Bu nedenle DNA aynı zincir tekrar tekrar sentezlenmiş olan bir çözelti içinde, yeni nükleotid zincir çünkü dideoksinükleotidleri bütünleştirilmesi (Russell, 2002) eklenmesi için bir potansiyele sahip bütün pozisyonlarda sona erer.
Bu şekilde, tüm değişik uzunluklarda bant üretilir.
Bu reaksiyon tamamlandıktan sonra, bir kez daha DNA elektroforezi için hazırlık içinde denatüre edilir.
Dört tüplerin her birinin içeriği üzerinde ayrı şeritler halinde çalıştırılır
polyacrylmide jel
birbirinden farklı büyüklükteki grupları ayırmak için.
Içeriği jel boyunca çalıştırıldıktan sonra, jel sonra DNA etiketleme için kullanılan yönteme bağlı olarak, UV ışığı veya X-Ray ya da maruz kalmaktadır.
Genetik

Şekil 2:
Bu, "G" tüp (aynı sekansları Şekil 1 'de görüldüğü gibi) içinde reaksiyonların polyacrylmide jel.
Astar gösterir onların ağır molekül weight.The mavi bölüm nedeniyle DNA uzun parçaları daha küçük parçalara daha kısa mesafelerde seyahat, siyah bölüm yeni sentezlenen iplikçik gösterir ve kırmızı zinciri (Metzenberg) sonlandırılmış bir ddGTP, ifade eder.
Şekil 2'de gösterildiği üzere, daha küçük parçalara zincirleri daha küçüktür ve bu nedenle jel üzerinde daha hızlı göç ederler çünkü ddNTP astar yakın ilave edildiğinde üretilmektedir.
Dört tüplerden reaksiyonların her biri jel, gerçek DNA sekansı kombine edilmesi durumunda yön-3 ', 5 jel üzerinden alt bant deseni okuma ile tespit edilebilir.
Bu dizi baştan şablonu iplikçik tamamlayıcı olduğunu olsa hatırlamak önemlidir.
Genetik

Şekil 3:
Bu, bir dideoksi dizileme jel bir autoradiogram olup.
Şerit üzerinde harfler nükleotid ki şerit ile temsil edilmektedir, örnek olarak kullanıldığı dideoksi gösterir.
Eğer yukarıya doğru okuduğunuzda, okurken
tamamlayıcı
şablonu iplikçik (Metzenberg) dizisi.

Otomatik Sekanslama
Biz 1974 yılından bu yana elde etmiş olduğu teknolojisindeki birçok gelişmeler ile, Sanger metodu eski haline gelmiştir sürpriz değildir.
Bununla birlikte, bu yöntem yerine ortaya çıkan yeni teknoloji Sanger yöntemi, aynı ilkelere dayanmaktadır.
Otomatik sıralama daha fazla DNA daha kısa bir süre içinde sıralı böylece geliştirilmiştir.
Otomatik işlemler ile reaksiyonlar bütün dört ddNTP Kullanıcı, farklı bir renk boya (Russell, 2002) ile etiketlenmiş her ihtiva eden bir tek tüp içinde gerçekleştirilir.
Genetik

Şekil 4:
otomatikleştirilmiş dizileme olarak, oligonükleotid primerleri farklı renk boyalar, her bir ddNTP için tek bir "uç-etiketli" olabilir.
Bu boyalar bir makine (Metzenberg) aracılığıyla okunan farklı dalga boylarında, az floresan.
Sanger metodunda olduğu gibi, DNA, bir jel üzerinde ayrılır, ama dört farklı olanları farklı olarak, hepsinin aynı şerit üzerinde çalıştırılır.
Genetik

Şekil 5:
otomatik dizge içinde boya etiketli DNA jel elektroforez sonuçları.
Jel dört reaksiyonlar gibi tüm DNA tek şeritli (Metzenberg) çalışan bir jel gösteren sağdaki resim aksine farklı şerit, çalıştırmak eğer neye benzediğini sol gösterileri görüntü.
Dört boyalar, farklı dalga boylarında flüorışı yana, bir lazer sonra fluoresces hangi dalga boyuna göre her bir grubun kimliğini belirlemek için jel okur.
Elde edilen sonuçlar daha sonra bir kromatogram şeklinde gösterilmektedir, ki (Russell, 2002) sırayla bu konumda nükleotid karşılık gelen renkli zirvelerin bir diyagramıdır.
Genetik

Şekil 6:
Bir kromatogram şeklinde gösterildiği gibi otomatik bir dizi sonuçları.
Renkleri dört baz temsil: mavi C, yeşil A, siyah G ve kırmızı T (Metzenberg) 'dir.

Referanslar
1.
Russell, Peter.
2002.
iGenetics.
Pearson Education, Inc, San Francisco, pp 187-189.
2.
Metzenberg, Stan.
Sanger Metodu-dideoksinükleotid Zincir Sonlandırma.
csun.edu/(Şubat, 2003) 10.
3.
Hız, Terrence.
Sanger Metodu.
statberkeley.edu/users/terry/classes/s260.1998/week8b/week8b...(Şubat, 2003) 10.